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肺癌

肺癌是中国乃至全世界最常见的恶性肿瘤以及首位的癌症死亡原因。根据世界癌症研究机构(IARC)的数据统计，2012年，全球肺癌新发病例约182.5万例，死亡病例约159.0万例。 据全国肿瘤登记中心的最新数据统计，2013年全国估计肺癌新发病例约73.28万例，占全部恶性肿瘤新发病例的19.90%，位居恶性肿瘤发病第一位。

晚期非小细胞肺癌患者的治疗进展很大程度受益于分子检测技术的进步，约69%的晚期非小细胞肺癌患者可以找到潜在受益的靶向药物。对于肿瘤的靶向治疗而言，靶向基因的分子分型意义重大，它能够与靶向药物特异性作用。例如EGFR-TKIs治疗对携带有EGFR、ALK突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者非常有效，BRAF抑制剂则对携带有BRAF突变的黑色素瘤患者有效，而携带有KRAS突变的患者对EGFR-TKIs治疗效果比较差。耐药性的产生往往是靶向治疗的一个重要障碍，耐药性是指患者在初次或者反复治疗与药物屡次接触后，对药物的敏感性下降甚至消失，致使药物对患者的疗效降低或无效。
现今，针对肿瘤变异位点的各种靶向药层出不穷，因此肿瘤组织的分子检测显得尤为重要，尤其当患者出现耐药之后的re-biopsies。但临床上通过re-biopsies获得组织病灶面临严峻挑战：
第一，肿瘤有异质性，尤其已经发生转移的患者，所取的组织样本并不能反映肿瘤病灶的整体变化；
第二，re-biopsies是侵入性的，对患者具有创伤性；
第三，组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。
液态活检(Liquid Biopsy)与传统组织活检相比有着迅速、便捷、无创等优点，临床医生可以监测肿瘤对治疗的应答、预后及复发。已有相关研究表明，通过血液中游离DNA（cfDNA）的分析能够整体反映肿瘤基因组水平的变化，包括原发灶和转移灶。因此对于血液检测而言，一方面需要确保检测的灵敏度，即能够在高背景野生型序列的条件下检测到突变序列；另一方面也需要确保检测结果的可靠性，尽可能避免假阳性。

由Geoffrey R. Oxnard发表在Clinic cancer research的一篇文章是第一篇采用ddPCR方法对晚期NSCLC患者进行EGFR突变（敏感突变和耐药突变）血液检测的论文，其结果展示了利用ddPCR进行肿瘤患者血液检测的可行性，有望转化为一种临床诊断的方法。

采用ddPCR技术灵敏而准确地动态检测治疗阶段病人血浆中癌症相关低丰度EGFR、BRAF和KRAS基因突变（包括耐药突变）含量变化，以便调整治疗方案。
入组患者与血样处理
1入组患者：晚期NSCLC患者和黑色素瘤患者。
2血液检测：携带EFGR和KRAS突变的NSCLC患者、携带BRAF突变的黑色素瘤患者。
3血样处理：收集10mL全血于EDTA抗凝管中，并在4小时内完成血浆分离。然后从2mL血浆内完成cfDNA的提取，最终体积约100uL。
ddPCR检测方法

1检测平台：QX100 droplet digital PCR System。检测流程图如下

2检测要求：每个样本设置3个复孔，1uL、2uL和4uL。
3检测位点   EGFR：L858R和Del 19；KRAS：G12C；BRAF：V600E。
检测结果：EGFR T790M耐药突变动态检测
根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）：9例接受一线厄洛替尼直至客观性疾病进展（PD）的患者EGFR突变血浆水平。在所有患者中，EGFR敏化突变（实线）的血浆水平响应于治疗而下降，8名患者（B-I）完全缓解；A患者为部分缓解，相较于完全缓解的患者，该患者更早的出现PD。 在6例患者中，EGFR敏感突变在PD前4个月内再次出现，并且也检测到较低浓度的T790M（虚线）。 在3例（G-I）患者中，即使出现PD后也未检测到T790M突变，继续接受erlotinib治疗。
研究意义
文章以NSCLC和黑色素瘤为例，首次采用ddPCR实现了高灵敏度、高特异性的血液检测，更重要的是对于其他实体瘤的血液检测也具有推广价值。随着第三代EGFR-TKI抑制剂奥斯替尼的上市，针对EGFR T790M位点，数字PCR作为一种伴随检测的方法体现了潜在的临床和商业价值。